Células madre: diferenciación al linaje dopaminérgico para el tratamiento del Parkinson (página 2)

Enviado por Carol Johanna Diaz Gutierrez

Partes: 1, 2

Fetales:

Se obtienen a partir del cordón umbilical y tienen
características similares a las adultas.

¿CÓMO SE
DESCUBRIERON LAS CÉLULAS MADRE?

Los científicos descubrieron hace más de 20
años el modo de obtener células
madre de embriones de ratones. Sin embargo, la primera vez
que se obtuvieron células
madre embrionarias humanas fue en 1994. Se aislaron a partir de
un blastocisto procedente de fecundación in vitro (FIV).

Blastocisto es el nombre que recibe el embrión de entre
una o dos semanas antes de implantarse en el útero
materno. Pero no fue hasta finales del año 1998 cuando un
grupo de
investigadores de la Universidad de
Wisconsin (EEUU) consiguió el primer cultivo en el
laboratorio de
células madre embrionarias humanas a partir de
blastocistos. Un cultivo o línea celular es un conjunto de
células que se dividen continuamente en el
laboratorio.

El poder crecer y
mantener estas células in vitro supuso el comienzo del
boom de las células madre. A partir de ese momento,
grupos de
investigación de todo el mundo han
estudiado las características moleculares de estas
células y han desarrollado sistemas
más eficaces para cultivarlas in vitro. Además, se
han hecho avances muy importantes a la hora de dirigir estas
células hacia un tipo celular concreto. Esto
ha originado que las células madre hayan adquirido un gran
potencial terapéutico por sus aplicaciones en la
regeneración de tejidos
dañados y restablecimiento de funciones
afectadas del cuerpo.3

¿QUÉ ES LA
ENFERMEDAD DE PARKINSON?

La enfermedad de Parkinson se caracteriza por una
degeneración progresiva de neuronas en el sistema nervioso
central, que afecta de forma marcada a las neuronas que
producen el mediador químico dopamina. El déficit
en este neurotransmisor da lugar a una serie de síntomas
que caracterizan a la enfermedad de Parkinson, el temblor, la
rigidez y la disminución en los movimientos
voluntarios.4

¿CÓMO SE CONSIGUE UN CULTIVO DE
CÉLULAS MADRE?

Existen varias estrategias pero
en todos los casos es un proceso largo,
complejo y, por el momento, con una tasa de éxito
baja. Para conseguirlo es necesario reproducir, en el
laboratorio, el escenario en el que estas células
actúan en el organismo. Además, estos modelos
experimentales tienen que cumplir una serie de
características:

Tienen que reflejar de forma exacta la biología de las
células madre.
Tienen que ser reproducibles, es decir, los experimentos se
tienen que poder repetir en el laboratorio.
Tienen que ser procesos de
una duración no muy larga, de modo que se puedan
desarrollar, analizar y repetir en un periodo de tiempo
razonable.

Si se quiere obtener un cultivo o
línea celular de células madre
embrionarias, el proceso comienza aislando, con técnicas
de microcirugía, la masa celular interna del
embrión. Esta masa de células se coloca sobre un
soporte de vidrio o plástico
donde existe un líquido rico en los nutrientes que
necesitan las células para multiplicarse y crecer.
Conforme las células van dividiéndose y aumenta su
número, se va repitiendo el proceso. Así al final
se obtiene una línea celular de células
embrionarias. Este cultivo seguirá dividiéndose
siempre que se mantenga bajo control el
ambiente y se
aporten los nutrientes necesarios para crecer.

Estrategia para obtener cultivos de células madre
embrionarias
a partir de un embrión.
(Fuente: smartplanet)

Hoy en día la mayoría de las líneas
de células madre embrionarias se generan a partir de
embriones de ratón. Sin embargo, los investigadores
están explorando nuevas formas para obtener este tipo de
células:

A partir de embriones sobrantes de procesos
de FIV: Se pueden generar líneas de
células madre embrionarias humanas a partir de embriones
creados mediante FIV. En este caso, como la fecundación
tiene lugar fuera del cuerpo de la mujer, es
posible crecer estos embriones en el laboratorio.
Mediante clonación terapéutica:
Las células madre también se pueden obtener por
el procedimiento
empleado para generar clones "enteros" como la oveja Dolly. Sin
embargo, al tener un uso estrictamente médico, se
denomina clonación terapéutica.

En este proceso (ver imagen), se
inserta el núcleo procedente de una célula
adulta del donante en el interior de un óvulo al que se le
ha quitado el núcleo. Así, el núcleo adulto
aporta toda la información genética
(el ADN) necesaria
para dividirse la célula
y el óvulo los nutrientes necesarios para que se lleve a
cabo este proceso. Mediante un estímulo (por ejemplo una
descarga química) se activa la multiplicación
de esta célula como si fuera un zigoto. A partir de
aquí se obtendrán células madre embrionarias
genéticamente idénticas al donante adulto. Por ello
esta técnica podría suponer una aproximación
valiosísima para generar tejidos sin riesgo de
rechazo.

Estrategias para obtener
cultivos de células madre embrionarias
mediante
clonación terapéutica.
(Fuente: smartplanet)

Para obtener una línea de células
madre adulta (imagen), en primer lugar hay que aislar
estas células de los distintos órganos del cuerpo,
por ejemplo de la médula ósea. A
continuación estas células se colocan en un soporte
con el ambiente y los nutrientes necesarios para que empiecen a
multiplicarse de forma equivalente a las embrionarias.

Estrategias para obtener cultivos de células madre
embrionarias
a partir de células madre
adultas. (Fuente: smartplanet)

En la diferenciación hacia un fenotipo
dopaminérgico, se deben de tener en cuenta diversos
factores tales como FGF-2, FGF-8, Shh, ácido
ascórbico, monofosfato de adenosina cíclico o BDNF
ya que se trata de simular el proceso de desarrollo
natural de estas neuronas pero in Vitro. Factores solubles de
la familia de
las Wnts secretadas por astrositos participan también en
la diferenciación de las células dopaminergicas.
Otro punto en la diferenciación dopaminergica de
precursores del mesencéfalo ventral incluye la
eliminación de mitógenos o adición de
factores solubles como el suero bovino fetal en
combinación con interleucinas (IL-1,IL-11), LIF, factor
neurotrofico derivado de una línea celular glial, un
amezcla de FGF-8, GDNF y Forskolin o el ácido
ascórbico.1 También manipulaciones
genéticas como la del gen Nurr 1 el cual es esencial para
la supervivencia de células precursoras dopaminergicas
mesenfalicas, así como también para su
diferenciación en células productoras de
dopamina.

PROTOCOLO
DE DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE AL LINAJE
DOPAMINÉRGICO

La diferenciación de las células madre
embrionarias se llevara a cabo mediante células estromales
no diferenciadas hESCs de la línea SA002.5 (Cellartis,
Gothenburg) y se realizara la diferenciación en el
Laboratorio de Biotecnología ME – CZH.

Las células del ES serán sembradas en
platos revestidos de gelatina y mantenidas en medio Glasgow MEM
complementado con 2000 U/ml LIF, 20 µg/mlblasticidina S,
suero vacuno fetal al 1%, aminoácidos no esenciales 0.1mM,
Piruvato 1mM y 2- mercaptoetanol 0.1mM.

Las células PA6 crecerán en un medio
esencial alfa, complementado con el 10% FBS, Penicilina 50
µg/mly estreptomicina 50 U/ml. Todas las células se
cultivaran en una incubadora con CO2 al 95% a
37ºC.

Las células madre embrionarias serán
cultivadas usando PA6 CM para inducir la diferenciación de
los nervios. Para preparar PA6 CM, las células confluentes
PA6 se lavaran tres veces con buffer fosfato salino, iones de
calcio y de magnesio [PBS (+)] y los medios
respectivos serán substituidos por G-MEM complementados
con el 5% de KSR, aminoácidos no esenciales 0.1mM,
Piruvato 1mM y con o sin 2 – mercaptoetanol 0.1mM y heparina (10
o 100 Âµg/ml). Después de 48 h, el
sobrenadante se recogerá y se filtrara con un filtro de
0.22 milímetros. El CM se recogerá usando 10
µg/mlde GMEM, y con 10 µg/ml de heparina;
están referidos como CM-0H, CM-10H y CM-100H
respectivamente.

Las células embrionarias se pondrán sobre
unas placas de cristal revestidas de poliornitina (sigma)
/fibronectina con una densidad de 1250
células/cm2 en G-MEM complementadas con KSR 5%,
aminoácidos no esenciales a 0.1mM, Piruvato 1mM y
2-mercaptoetanol 0.1mM. Después de 5 horas, CM-0H, CM-10H
(la concentración final de heparina es 3.3 mg/ml) o
CM-100H (concentración final de heparina es 33 mg/ml)
serán agregadas a la placa con una relación de 1:3
volúmenes de medio de cultivo y luego se mezclaran bien.
Todas las placas se mantendrán a 37 ºC con el 5% de
CO2 por 16 días.5

ANÁLISIS INMUNO
HISTOQUÍMICO:

Los cultivos celulares preparados para el estudio de la
diferenciación de neuronas de DA mediante las
células derivadas de la
actividad estromal (SDIA) de hESCs, serán visualizados por
un microscopio
fluorescente de Zeiss (Carl Zeiss, Jena, Alemania,
http://www.zeiss.com) con cámara digital.
El número total de colonias positivas de tirosina
hidroxilasa serán contadas.

Para definir una colonia como inmunoreactiva
aproximadamente el 10% de las células deben colorearse por
efecto del marcador. Los números de células fueron
determinados usando un sistema de la
Echar-Rejilla de Olympus (Olympus). Usando una técnica
sistemática de muestreo al azar,
los núcleos seran delineados por la acción
de HNuc y de BrdU o neuronal (NeuN) – o las células
TH-positivas serán determinadas en un % de las
áreas.6

BIBLIOGRAFÍA

Caracterización de efectores de
diferenciación gabaergica en células madre como
herramienta terapéutica de enfermedades
neurodegenerativas. Martin Ibáñez
Raquel
Adult stem cells. F. Prósper, C.M. Verfaillie.
Servicio de
Hematología y Área de Terapia
Celular.
http://gslc.genetics.utah.edu/units/stemcells/scsuccess/
CÉLULAS MADRE Y ENFERMEDAD DE
PARKINSON. Ernest Arenas Laboratorio de
Neurobiología Molecular, MBB, Karolinska Institute,
Estocolmo, Suecia 5. Pérdida de las neuronas
dopaminérgicas mesencefálicas por la
inactivación del gen Nurr1. Odila Saucedo
Cárdenas, Roberto Montes de Oca Luna.
YAMAZOE Hironori, IWATA Hiroo. Efficient generation
of dopaminergic neurons from mouse
embryonic stem cells enclosed in hollow fibers.
2006.
BREDERLAU, Anke et al. Transplantation of Human
Embryonic Stem Cell-Derived Cells to a Rat Model of
Parkinson’s disease: Effect of In Vitro Differentiation
on Graft Survival and Teratoma Formation. 2008.